Alat Bantu Hitung Melting Temperature (Tm) Primer

Intruksi

Alat bantu ini menyelaraskan dengan pendekatan perhitungan NEB (New England Biolabs) dalam optimasi PCR menggunakan data termodinamika SantaLucia (1998) dan koreksi garam Owczarzy (2008).

Gunakan kalkulator ini sebelum melakukan reaksi PCR atau merancang primer untuk memprediksi suhu annealing (Ta) optimal untuk keseimbangan spesifisitas dan yield produk yang ideal, khususnya saat menggunakan enzim High-Fidelity atau Q5.

Pitfalls: Selalu pilih Kit PCR yang sesuai karena setiap buffer enzim komersial memiliki formula termodinamika proprietary (seperti Phusion vs Taq standar) yang mengubah suhu leleh oligonukleotida Anda.

Pendekatan Nearest-Neighbor menggantikan penghitungan \%GC sederhana. Formulasi memperhitungkan konsentrasi dinamis dNTP dan ion Magnesium (Mg2+) di mana Mg2+ bebas berkompetisi mengikat rantai heliks.

---

PCR Setup & Kit Methodology

Product Group

Polymerase/Kit

Method: SantaLucia (1998)

Primer Conc.

nM

Salt (K+/Na+)

mM

Mg²⁺

mM

dNTPs

mM

---

Sequence Input

Primer 1 (Forward)

Primer 2 (Reverse)

---

Recommended Ta:

--°C

ΔTm: --°C

Silakan masukkan sequence Primer 1 dan Primer 2 (minimal 4 basa) untuk memulai kalkulasi otomatis.

---

Thermodynamic Profiles

Primer 1 Profile

Thermo. Tm: --°C

Wallace Rule (Basic $T_m$): --°C

Length

-

%GC

-

Mw

-

Primer 2 Profile

Thermo. Tm: --°C

Wallace Rule (Basic $T_m$): --°C

Length

-

%GC

-

Mw

-

---

Saran Desain Primer

• Pastikan ΔTm antara primer Forward dan Reverse tidak lebih dari 5°C untuk mencegah penempelan asimetris (asymmetric amplification).
• Disarankan rentang primer optimal berada pada 18-24 nukleotida.
• Jika amplifikasi spesifik gagal pada Ta rekomendasi alat ini, pertimbangkan menggunakan gradien PCR ±2°C hingga 5°C.

Metodologi & Formula

Perhitungan dasar Melting Temperature (Tm)
Digunakan dua perhitungan perkiraan standar. Untuk urutan kurang dari 14 nukleotida, rumusnya adalah:
$${Tm} = {(wA+xT) \times 2 + (yG+zC) \times 4}$$ di mana w, x, y, z adalah jumlah basa A, T, G, C dalam urutan tersebut, masing-masing.
Untuk urutan lebih dari 13 nukleotida, persamaan yang digunakan adalah
$$Tm= {{64.9 +41 \times (yG+zC-16.4)} \over (wA+xT+yG+zC)}$$ Ketika nukleotida degeneratif dimasukkan dalam urutan primer (Y, R, W, S, K, M, D, V, H, B, atau N), nukleotida tersebut akan diganti secara internal sebelum perhitungan Tm minimum dan maksimum.

    Contoh:
    Urutan primer:                      	CTCTRYCTWSCTCTCT
    Urutan untuk perhitungan Tm minimum:   	CTCTATCTAGCTCTCT
    Urutan untuk perhitungan Tm maksimum:   	CTCTGCCTAGCTCTCT

Asumsi: Persamaan di atas mengasumsikan bahwa pengaitan terjadi di bawah kondisi standar dari 50 nM primer, 50 mM Na+, dan pH 7.0.

Pengembangan parameter termodinamika SantaLucia (1998) dan koreksi garam Owczarzy (2004/2008) untuk akurasi maksimal.

1. Nearest-Neighbor \(T_m\) Formula

\[T_m = \frac{\Delta H^\circ \times 1000}{\Delta S^\circ + R \ln(C_p)} - 273.15\]

Dimana \(R\) adalah gas constant (\(1.987 \, \text{cal/K}\cdot\text{mol}\)) dan \(C_p\) adalah konsentrasi primer.

2. Salt Correction (Owczarzy 2004)

\[\frac{1}{T_m(X)} = \frac{1}{T_m(1\text{M})} + (4.29 \cdot f_{GC} - 3.95) \cdot 10^{-5} \ln[K^+] + 9.4 \cdot 10^{-6} \ln[K^+]^2\]

3. Salt Correction (Schildkraut 1965)

\[T_{m}(X) = T_{m}(1\text{M}) + 16.6 \log_{10}[K^+]\]

Digunakan khusus untuk perhitungan polimerase tipe Phusion.

4. Annealing Temperature (\(T_a\)) Rules

• Q5 / Q5 Hot Start: \(T_a = \min(T_m) + 1^\circ\text{C}\)
• Phusion / Phusion Hot Start: \(T_a = 0.93 \cdot \min(T_m) + 7.5^\circ\text{C}\)
• Standard Taq (OneTaq/Taq): \(T_a = \min(T_m) - 5^\circ\text{C}\)
• Vent / Deep Vent: \(T_a = \min(T_m) - 2^\circ\text{C}\)

5. Wallace Rule (Basic \(T_m\))

Tm = 2(A+T) + 4(G+C)

Tim Pembuat & Kontributor

Sodikin Kurniawan, S.Tr.A.K.M.Kes

CREATOR

Penulis algoritma Nearest-Neighbor.

Referensi & Disclaimer

• New England Biolabs (NEB): Source for high-fidelity PCR methodology and \(T_a\) rules.
• SantaLucia (1998): Thermodynamic parameters.
• Owczarzy (2004): Salt correction data.
• Schildkraut (1965): Salt correction (Phusion).

---

Disclaimer: Alat ini adalah sumber daya edukasi independen. NEB® dan Q5® adalah merek dagang terdaftar dari New England Biolabs, Inc. Sesuai standar industri untuk kompatibilitas reagen.